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氯黴素乙酰基轉移酶cat:該報告基因來源於大腸桿菌轉位子9,是第1個用於檢測細胞內轉錄活性的報告基因。氯黴素乙酰基轉移酶可催化乙酰a的乙酰基轉移到氯黴素3羥基,而使氯黴素解毒。cat在哺乳細胞無內源性表達,性質穩定,半衰期較短,適於瞬時表達研究。可用同位素、熒光素和酶聯免疫吸附測定檢測其活性。也可進行蛋白質印跡和免疫組織化學分析。cat與其他報告基因相比,線性範圍較窄,靈敏性較低。
β半乳糖苷酶:β半乳糖苷酶由大腸桿菌cz基因編碼。可催化半乳糖苷水解。最大優勢是易於用免疫組織化學法觀測其原位表達,是最常用的監測轉染率的報道基因之一。以鄰-硝基苯-β-d-半乳吡喃糖苷onpg爲底物可用標準的比色法檢測酶活性,其檢測動力學範圍爲6個數量級。氯酚紅-β-d-半乳吡喃糖苷cprg是另一個可用比色法檢測酶活性的底物,其靈敏度比onpg高近10倍。以ug和熒光素二半乳糖苷fdg爲底物則可用熒光法檢測其活性。此法可檢測單個細胞的酶活性,並可用於流式細胞學facs分析。如以二氧雜環丁烷爲底物,可用化學發光法檢測酶活性,其檢測動力學範圍最大,靈敏度最高,與用生物發光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。
熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發光的一類酶。哺乳細胞無內源性熒光素酶。最常用的熒光素酶有細菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和renil熒光素酶。細菌熒光素酶對熱敏感,因此在哺乳細胞的應用中受到限制。螢火蟲熒光素酶靈敏度高。檢測線性範圍寬達7~8個數量級,是最常用於哺乳細胞的報道基因。用熒光比色計即可檢測酶活性,因而適用於高通量篩選。隨着具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的應用,無需裂解細胞即可檢測酶活性。renil熒光素酶催化腸腔素氧化,產物可透過生物膜,可能是最適用於活細胞的報告分子。將熒光素酶報告基因載體轉染到細胞中,可用熒光素酶檢測系統靈敏方便地測定熒光素酶基因的表達。自1986年起,螢火蟲熒光素酶基因被用作測定基因表達的報告基因,獲得了廣泛的應用ga公司的pgl3及pgl2系列載體,含sv40啓動子及增強子的不同組合,有助於分析dna片段的轉錄活性。
“主人,成功了!”
不知道過了多久,墨蓮人恭敬地對李安道。
李安滿意地看着自己的身體,然後進入了這個軀體之中!未完待續